Change search
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • harvard1
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
Investigation of a cytochrome c from Ideonella dechloratans
2004 (English)Independent thesis Basic level (professional degree)Student thesis
Abstract [sv]

Denna rapport undersöker hur elektronerna transporteras från quinonpoolen i cytoplasmamembranet, till kloratreduktaset i periplasman hos den kloratrespirarande bakterien Ideonella dechloratans. Syftet med rapporten är att undersöka en DNA-sekvens, som kodar för ett lösligt c cytokrom och finns nedströms i kloratreduktas klustret, genom att uttrycka hemproteinet heterologt i Eschericha coli. Expression av c cytokromer i Eschericha coli kräver induktion av cytokrom c mognads systemet, (Ccm). Amplifiering av målproteinet var endast möjlig med ”Touch-Down”-PCR och Advantage®- GC Genomic PCR Kit, troligen på grund av GC-innehållet. PCR-produkten klonades in i en expressionsvektor med en pelB-signalpeptid uppströms och en His6-Tag nedströms, vilket gav expressionsplasmiden pSW03/6. Anaerob tillväxt av pSW03/6 i BL21(DE3) var i berikad M9-minimal medium med nitrat eller nitrit som terminal elektronacceptor. Anaerob induktion av Ccm-systemet och expression av målproteinet (2.5 mM nitrit, 1 mM IPTG) uppvisar ett överuttryck av apoprotein. Det är tydligt att den inducerade kulturen lägger sin energi på annat än tillväxt, exempelvis på proteinexpression. Aerob tillväxt både av pEC86, innehållande Ccm-operonet, och pSW03/6 i NovaBlue(DE3), var i LB-medium / Kan. / Cam. Aerob expression vid 30 °C / 1 mM IPTG gav ett överuttyck av apocytokrom. Odling vid 37°C och induktion med 0.1 mM IPTG, gav holocytokrom c både i den cytoplasmiska- och olösliga fraktionen. Efter tillväxt vid 30 °C och induktion med 10 µM IPTG, avslöjades en liten mängd holocytokrom c i periplasman, medan den större delen var membranassocierad. Av resultaten kan slutsatsen dras att tillväxt vid 37 °C och en induktion med antingen 10 µM IPTG eller ingen induktion alls, borde vara framgångsrikt för expression av lösligt holoprotein.

Abstract [en]

Division of Chemistry Investigation of a cytochrome c from Ideonella dechloratans Heterologous expression in Eschericha coli under aerobic and anaerobic conditions Diploma Thesis Biochemistry Sara Wahlberg Examiner and Supervisor: Thomas Nilsson Karlstad University 2004 The present work deals with the electron transfer from the quinone pool in the cytoplasmic membrane to the chlorate reductase in the periplasm of the chlorate respirerer Ideonella dechloratans. The aim of this report is to investigate a DNA-sequence encoding a soluble ctype cytochrome found downstream the chlorate reductase cluster, by expressing the haemoprotein heterologously in Eschericha coli. Expression of c-type cytochromes in Eschericha coli requires the induction of the cytochrome c maturation-system (Ccm). The amplification of the sequence was only successful by Touch-Down PCR and the Advantage®-GC Genomic PCR Kit, probably due to the GC-content. The resulting product was cloned into an expression vector containing an upstream pelB leader sequence and an downstream sequence encoding a His6-Tag, yielding the expression plasmid pSW03/6. Anaerobic growth of the BL21(DE3) host harbouring the pSW03/6, was in enriched M9- minimal medium with nitrite or nitrate as terminal electron acceptor. Anaerobic induction of the Ccm-system and expression of the target gene (2.5 mM nitrite, 1 mM IPTG) reveals an overexpression of apoprotein. The lesser growth in the induced culture compared to the uninduced culture, may indicate an energy costing protein expression. Aerobic growth of NovaBlue(DE3), harbouring both pSW03/6, and the pEC86-plasmid, containing the Ccmoperon, was carried out in LB-medium / Kan. / Cam. Growth at 30 °C and the induction with 1 mM IPTG, yielded an overexpression of the apocytochrome. Growth at 37 °C and induction by 0.1 mM IPTG yielded holocytochrome c both in the soluble and insoluble fractions. After the growth at 30 °C and induction with 10 µM IPTG, some holocytochrome c was found in the periplasm, but the largest part was found associated to the membrane. It is concluded that raising the temperature to 37 °C and the induction with 10 µM IPTG, or no induction at all, could be successful to increase the amount of soluble holocytochrome c.

Place, publisher, year, edition, pages
2004. , 27 p.
Identifiers
URN: urn:nbn:se:kau:diva-52555Local ID: KEM-22OAI: oai:DiVA.org:kau-52555DiVA: diva2:1101082
Subject / course
Chemistry
Available from: 2017-05-29 Created: 2017-05-29

Open Access in DiVA

No full text

Search outside of DiVA

GoogleGoogle Scholar

CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • harvard1
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf